廣州2021年4月6日 /美通社/ -- 基準醫(yi)療（AnchorDx）與(yu)中山大學(xue)附屬第(di)六醫(yi)院的(de)蘭平教授和(he)吳現瑞教授團隊在Molecular Oncology（影響因子: 6.574）發表了一篇(pian)題為“A novel cell-free DNA methylation-based model improves the early detection of colorectal cancer”的(de)研(yan)究論文。

結直(zhi)腸癌（CRC）是(shi)全球第三(san)大最常見的(de)(de)惡性腫瘤，盡(jin)管治(zhi)療方(fang)法有所(suo)改善，但TNM晚期(qi)CRC患者的(de)(de)預(yu)后仍較差(cha)。I期(qi)CRC患者的(de)(de)5年生存(cun)率(lv)為91%，而(er)IV期(qi)僅為14%。因此，對早期(qi)CRC的(de)(de)精準篩查是(shi)降(jiang)低CRC相關(guan)死亡率(lv)的(de)(de)關(guan)鍵(jian)策略之(zhi)一。

目(mu)前(qian)(qian)，CRC篩(shai)(shai)查(cha)方(fang)法主要(yao)分為有創結(jie)腸(chang)鏡檢(jian)查(cha)和無創大便(bian)CRC篩(shai)(shai)查(cha)，有創結(jie)腸(chang)鏡檢(jian)查(cha)存在(zai)對(dui)技術和設備要(yao)求高、檢(jian)查(cha)前(qian)(qian)需(xu)要(yao)徹底(di)清潔腸(chang)道、侵入性(xing)檢(jian)查(cha)會帶來一定(ding)的(de)痛苦和并(bing)發(fa)癥風險、患者依從(cong)性(xing)差等(deng)問(wen)題(ti)；而無創大便(bian)CRC篩(shai)(shai)查(cha)存在(zai)假陽性(xing)率高、非(fei)必(bi)要(yao)的(de)治療、價格相(xiang)對(dui)較高、缺乏長期隨訪研究數據等(deng)問(wen)題(ti)，現階段迫切需(xu)要(yao)一種高靈敏(min)度和特異度的(de)無創性(xing)CRC篩(shai)(shai)查(cha)產品。

本(ben)項目研究通過(guo)187個(ge)組織(zhi)DNA樣本(ben)（91個(ge)非惡(e)性組織(zhi)，26個(ge)進(jin)展(zhan)期腺瘤[AA]和70個(ge)CRC）和489個(ge)血漿cfDNA樣本(ben)進(jin)行靶向DNA甲基(ji)化測序，建立并驗證了(le)用于AA和早期CRC非侵(qin)入性檢測的基(ji)于11個(ge)DNA甲基(ji)化生物標志物的cfDNA甲基(ji)化模型。

1、研究工作流程

為鑒定結(jie)直(zhi)腸癌(ai)(ai)（CRC）特(te)異(yi)的(de)(de)DNA甲(jia)(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)標(biao)志物(wu)(wu)(wu)，研究(jiu)者(zhe)收(shou)集了313個組(zu)織(zhi)樣(yang)(yang)本(ben)(ben)（139例(li)(li)正常，30例(li)(li)進(jin)展期(qi)(qi)腺瘤[AA]和(he)(he)(he)144例(li)(li)結(jie)直(zhi)腸癌(ai)(ai)[CRC]）進(jin)行靶向(xiang)DNA甲(jia)(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)二代測(ce)序(xu)（NGS）。此外，為進(jin)一步探(tan)索這些DNA甲(jia)(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)標(biao)志物(wu)(wu)(wu)在(zai)CRC早期(qi)(qi)檢(jian)測(ce)中(zhong)的(de)(de)臨(lin)床(chuang)應(ying)用(yong)，采集了577例(li)(li)血漿樣(yang)(yang)本(ben)(ben)（169例(li)(li)健(jian)康對(dui)照組(zu)、44例(li)(li)非進(jin)展期(qi)(qi)腺瘤[NAA]、76例(li)(li)AA和(he)(he)(he)288例(li)(li)CRC）進(jin)行NGS測(ce)序(xu)分析。經(jing)過DNA提(ti)取(qu)、文(wen)庫構(gou)建和(he)(he)(he)DNA甲(jia)(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)測(ce)序(xu)的(de)(de)質控，最(zui)終分析了187個組(zu)織(zhi)樣(yang)(yang)本(ben)(ben)和(he)(he)(he)489個血漿樣(yang)(yang)本(ben)(ben)。應(ying)用(yong)Wilcoxon檢(jian)驗(yan)和(he)(he)(he)Benjamini-Hochberg多重檢(jian)驗(yan)篩(shai)(shai)選(xuan)組(zu)織(zhi)隊(dui)列(lie)，得到(dao)了667個CRC特(te)異(yi)的(de)(de)DNA甲(jia)(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)標(biao)志物(wu)(wu)(wu)。將(jiang)133例(li)(li)正常血漿樣(yang)(yang)本(ben)(ben)和(he)(he)(he)248例(li)(li)CRC血漿樣(yang)(yang)本(ben)(ben)隨機分組(zu)到(dao)訓(xun)練和(he)(he)(he)驗(yan)證集中(zhong)，進(jin)行建模(mo)(mo)(mo)分析，從該(gai)667個生(sheng)物(wu)(wu)(wu)標(biao)志物(wu)(wu)(wu)中(zhong)進(jin)一步篩(shai)(shai)選(xuan)CRC特(te)異(yi)甲(jia)(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)標(biao)志物(wu)(wu)(wu)。在(zai)LASSO選(xuan)擇后(hou)，基(ji)(ji)于訓(xun)練集獲得11個CRC特(te)異(yi)性甲(jia)(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)標(biao)志物(wu)(wu)(wu)，然后(hou)使用(yong)驗(yan)證集進(jin)一步確認。最(zui)終，通過對(dui)NAA、AA和(he)(he)(he)CRC患者(zhe)的(de)(de)診斷來評估(gu)該(gai)模(mo)(mo)(mo)型的(de)(de)臨(lin)床(chuang)價值(zhi)。同時，通過與癌(ai)(ai)胚抗原(yuan)（CEA）和(he)(he)(he)碳水(shui)化(hua)(hua)合物(wu)(wu)(wu)抗原(yuan)19-9（CA19-9）方法(fa)的(de)(de)比較(jiao)，評估(gu)了該(gai)模(mo)(mo)(mo)型在(zai)CRC管(guan)理(li)中(zhong)的(de)(de)穩定性。（Figure 1）

2、健康對照組、NAA、AA和CRC患者的cfDNA提取分析

比較551例（162例健康對照[正常]、44例非進展期腺瘤[NAA]、74例進展期腺瘤[AA]、69例結直腸癌I期[I]、97例結直腸癌II期[II]、70例結直腸癌III期[III]、35例結直腸癌IV期[IV]）cfDNA質控合格的樣本的cfDNA濃度。數據顯示為平均值±標準差（SD）；ns，不顯著（Figure 2，***p<0.001；****p<0.0001）。

3、組織DNA甲基化圖譜的表征

187個組織樣本中(zhong)667個結直(zhi)腸癌（CRC）特異DNA甲基(ji)化生物標志(zhi)物的(de)(de)無監督(du)分層聚(ju)類分析（Figure 3A）。CRC、進展(zhan)期腺瘤（AA）和正常樣本的(de)(de)主成分分析（Figure 3B）。CRC與AA組甲基(ji)化模式的(de)(de)相(xiang)關(guan)性(xing)分析（Figure 3C）。基(ji)于9921個生物標志(zhi)物計算(suan)平(ping)均甲基(ji)化水平(ping)。圖中(zhong)的(de)(de)值(zhi)是與正常樣本共甲基(ji)化值(zhi)（PCM）的(de)(de)比值(zhi)，然后進行Log2轉換(huan)來生成的(de)(de)。

4、cfDNA甲基化模型檢測腺瘤和CRC患者的性能和風險評分

在訓練和驗證集中，模型的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.90（0.85-0.94）和0.92（0.88-0.96）（Figure 4A-B）。應用于腺瘤患者的診斷時，該模型在腺瘤、非進展期腺瘤（NAA）和進展期腺瘤（AA）中分別達到0.82（0.76-0.87）、0.77（0.69-0.86）和0.85（0.78-0.91）（Figure 4C-E）。該模型在I期結直腸癌檢測中的AUC為0.90（0.86-0.95）（n=199）（Figure 4F）。該模型在結直腸癌（CRC）患者的診斷中表現突出，AUC為0.91（0.88-0.94）（n=381）（Figure 4G）。在CRC和AA隊列（n=449）的檢測中，模型的總體AUC為0.90（0.87-0.93）（Figure 4H）。模型在健康對照（正常）和NAA、AA以及結直腸癌I-IV期患者中的風險評分（n=489，配對t檢驗；Figure 4I，*****p<0.0001）。

5、cfDNA甲基化模型與腫瘤生物標志物CEA和CA19-9的CRC診斷性能比較

cfDNA甲基化(hua)模型、癌(ai)胚抗原（CEA）和碳水化(hua)合物抗原19-9（CA19-9）檢測結直腸癌(ai)（CRC）的ROC曲線下面積(ji)分別(bie)為(wei)0.91（0.88-0.94）、0.77（0.72-0.82）和0.59（0.53-0.65；Figure 5）。

本研究建立并驗證了用于AA和早期CRC非侵入性檢測的基于11個DNA甲基化生物標志物的cfDNA甲基化模型。我們收集了來自CRC、進展期腺瘤（AA）、非進展期腺瘤和健康對照組的313個組織和577個血漿樣本，去除質控不合格的，選擇187個組織DNA樣本（來自CRC患者的91個非惡性組織，26個AA和70個CRC）和489個血漿cfDNA樣本進行靶向DNA甲基化測序。在訓練隊列中基于11個甲基化生物標志物（ROC曲線下面積[AUC]=0.90[0.85-0.94]）開發了一個用于CRC檢測的cfDNA甲基化模型，該模型在驗證隊列（AUC=0.92[0.88-0.96]）中得到驗證。本研究建立的cfDNA甲基化模型能夠穩定地診斷出早期CRC（AUC=0.90[0.86-0.95]）或AA（AUC=0.85[0.78-0.91]）的患者。該模型將在CRC的早期診斷臨床實踐中發揮著積極作用。

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